Torre campanario de la Iglesia Mayor de San Sebastián. Al fondo, la iglesia de San José.

Sobre la fecha del inicio de las obras no se tiene certeza ni constancia documentada, pero se sabe que en 1547 el templo se hallaba en construcción, como lo atestigua la controversia que existiera entre el cabildo de la catedral hispalense y el Ayuntamiento de la Villa con motivo de la extracción de piedra de las canteras de Puerto Real, y el destino de dicha piedra, necesaria tanto para la capilla real de la catedral sevillana como para las obras de edificación de la iglesia parroquial puertorrealeña.

En 1579, por mandato del obispo de Cádiz D. García de Haro, se hizo un retablo para la iglesia mayor de Puerto Real, encargándose de pintar, dorar y estofar cicho retable M. Vallés y P. Román. Además consta que Antonio Laínez, orfebre probablemente cordobés y afincado en Cádiz, contrató en 1580 un inciensario para la iglesia de Puerto Real, lo cual indicaría que este templo se encontraba abierto al culto antes de la fecha de 1592.